Neurogénesis GABAérgica adulta en el pallium de pez cebra (Danio rerio)

Abstract

La neurogénesis adulta es el proceso por el cual se generan nuevas neuronas en el cerebro de individuos adultos. Las nuevas neuronas se generan a partir de células madre neuronales (CMN) inmersas en nichos neurogénicos, microambientes celulares que gatillan la división y diferenciación a fenotipo neuronal. La neurogénesis adulta ha sido observada en una gran variedad de vertebrados, desde peces hasta humanos. Sin embargo, en los vertebrados más primitivos, tales como los peces y anfibios, los niveles de neurogénesis adulta son mayores y este fenómeno se distribuye a lo largo y ancho del sistema nervioso central, en comparación con aves y mamíferos. El pez cebra (Danio rerio) es uno de los principales modelos animales donde se ha estudiado la neurogénesis adulta. Solamente en el telencéfalo, se estima la presencia de 16 nichos neurogénicos diferentes, distribuidos a lo largo de la zona periventricular en la porción dorsal (pallium) y ventral (subpallium). Las nuevas neuronas se generan en estos nichos y posteriormente migran radialmente hacia el interior del parénquima conforme maduran. El pallium es una región abocada al procesamiento de información relacionado con las emociones, la memoria y el aprendizaje. Esta estructura puede subdividirse en varias regiones, entre ellas, el pallium dorsomedial (Dm) y el dorsolateral (Dl); donde ambas presentan un alto grado de neurogénesis adulta y plasticidad neuronal. Tanto en Dm como en Dl hay neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas. Durante el desarrollo embrionario las neuronas glutamatérgicas se generan a partir de CMN NeuroD1+ ubicadas en el pallium y las neuronas GABAérgicas se generan en el subpallium a partir de CMN Zash1a+ y luego migran hacia su ubicación final en el pallium. Este trabajo tiene el objetivo de determinar si en el pallium de pez cebra adulto hay neurogénesis GABAérgica, teniendo la hipótesis de que su generación es local y que no es necesaria la migración subpalial. Para probar esta hipótesis utilizamos peces cebra adultos, entre 9-12 meses de edad, de la línea transgénica tg (GAD:GFP). Esta línea se caracteriza por expresar la proteína verde fluorescente (GFP) bajo la regulación del promotor de la enzima Descarboxilasa del Ácido Glutámico (GAD), las neuronas GABAérgicas expresan el reportero fluorescente. Mediante administración intra-peritoneal de un análogo exógeno de timidina (EdU), marcamos cohortes de CMN en división y sacrificamos peces a 1.5, 3, 8 y 16 días post-inyección (dpi) de EdU. Para cada intervalo temporal, evaluamos el número de neuronas nuevas, su fenotipo neuronal mediante técnicas de inmunohistoquímica y su posicionamiento en el pallium. Entre 3 y 8 dpi aproximadamente un 80% de las células EdU positivas expresan el marcador glutamatérgico Neurod1, valor que disminuye a 60% a tiempos posteriores. En contraste, solamente un 2-3% de las células EdU positivas poseen expresión del marcador de fenotipo GABAérgico, GFP. Llamativamente, un 93% de las neuronas EdU-GFP presentan también expresión de Neurod1. Mediante análisis preliminar de un base de secuenciación de RNA a partir de células aisladas del telencéfalo, se observó que los marcadores glutamatérgicos y GABAérgicos se excluyen entre sí en casi la totalidad de las células, sugiriendo un compromiso entre ambos fenotipos. Sin embargo, encontramos que aproximadamente un 1% de las neuronas GABAérgicas presentan una expresión simultánea de Neurod1 o tbr1 (otro marcador glutamatérgico rio debajo de Neurod1), soportando nuestras observaciones previas. Por último, con el fin de evaluar si Neurod1 y GFP pueden ser indicadores de maduración neuronal se midieron sus niveles de expresión en neuronas GFP+ y se evaluó su variación en función a la distancia peri-ventricular. Encontramos que los niveles de expresión de GFP aumentan, mientras que los de NeuroD1 disminuyen en función a la distancia peri-ventricular. Nuestro análisis témporo-espacial de neuronas EdU-GFP, como los análisis preliminares de RNA-seq junto a las observaciones de GFP y NeuroD1 en neuronas GAD+ respaldan la idea de que en el pallium del pez cebra adulto se generan neuronas GABAérgicas.

Adult neurogenesis is the process by which new neurons are generated in the brain of adult individuals. New neurons are generated from neural stem cells (NSCs) immersed in neurogenic niches, cellular microenvironments that trigger division and differentiation to a neuronal phenotype. Adult neurogenesis has been observed in a wide variety of vertebrates, from fish to humans. However, in more primitive vertebrates, such as fish and amphibians, levels of adult neurogenesis are higher and this phenomenon is distributed throughout the central nervous system, compared to birds and mammals. Zebrafish (Danio rerio) is one of the main animal models where adult neurogenesis has been studied. In the telencephalon alone, approximately 16 different neurogenic niches are distributed throughout the periventricular zone in the dorsal (pallium) and ventral (subpallium) portions. New neurons are generated in these niches and subsequently migrate radially into the parenchyma as they mature. The pallium is a region dedicated to processing information related to emotions, memory and learning. This structure can be subdivided into several regions, including the dorsomedial (Dm) and dorsolateral (Dl) pallium; where both present a high degree of adult neurogenesis and neuronal plasticity. In both Dm and Dl there are glutamatergic and GABAergic neurons. During embryonic development, glutamatergic neurons are generated from NeuroD1+ CMNs located in the pallium, whereas GABAergic neurons are generated in the subpallium from Zash1a+ CMNs. In this work I aim to determine if there is GABAergic neurogenesis in the pallium of adult zebrafish, under the hypothesis that its generation is local to pallial circuits. To test this, we used the transgenic adult zebrafish, tg (GAD:GFP). This line is characterized by expressing green fluorescent protein (GFP) under the regulation of the Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) enzyme promoter; in this way, GABAergic neurons express the fluorescent reporter. By intra-peritoneal administration of an exogenous thymidine analogue (EdU), we label cohorts of dividing NSCs and sacrificed fish at different times, 1.5, 3, 8 and 16 days post-injection (dpi) of EdU. For each time interval, we evaluated the number of new neurons, their neuronal phenotype and their position in the pallium. Between 3 and 8 dpi, approximately 80% of EdU-positive cells express the glutamatergic marker Neurod1, a value that decreases to 60% at later times. In contrast, only 2-3% of EdU-positive cells have expression of the GABAergic phenotype marker, GFP. Strikingly, 93% of EdU-GFP neurons also show expression of Neurod1. Through preliminary analysis of an RNA sequencing of cells isolated from the telencephalon, it was observed that glutamatergic and GABAergic markers exclude each other in almost all of the cells, suggesting a compromise between both phenotypes. However, we found that approximately 1% of GABAergic neurons present a simultaneous expression of Neurod1 or tbr1 (another glutamatergic marker downstream of Neurod1), supporting our previous observations. Finally, in order to evaluate whether Neurod1 and GFP can be indicators of neuronal maturation, their expression levels were measured in GFP+ neurons and their variation was evaluated depending on the peri-ventricular distance. We found that the expression levels of GFP increase, while those of NeuroD1 decrease depending on the peri-ventricular distance. Our temporal-spatial analysis of EdU-GFP neurons, as well as preliminary RNA-seq analyzes together with observations of GFP and NeuroD1 in GAD+ neurons, support the idea that GABAergic neurons are generated in the pallium of adult zebrafish.