Caracterización molecular de los componentes del reloj circadiano y su relación con la producción de compuestos fotoprotectores en Aureobasidium pullulans

Abstract

En los últimos años, la secuenciación de levaduras y otros hongos salvajes ha permitido esclarecer diversas cuestiones sobre su origen, adaptación y evolución. Variantes aisladas de ambientes diversos han revelado una plétora de genes con el potencial codificante de compuestos de interés aplicado, a la vez que la diversidad genómica descubierta ha permitido clarificar la historia evolutiva de diversas especies. La historia natural del noroeste de la Patagonia ha moldeado la evolución de los genomas de diversos organismos en la región, incluyendo a los microorganismos. El ambiente cambiante y desafiante ha contribuido a crear y mantener un hotspot de diversidad de distintas especies de levaduras que apenas ha comenzado a explorarse. Aureobasidium pullulans, un hongo levaduriforme con notable plasticidad fenotípica ampliamente estudiado por su importancia industrial, es la especie dominante del filoplano del bosque andino-patagónico. A. pullulans CRUB 1823 es una cepa aislada de este ambiente sometido a las inclemencias del frío, la desecación por el viento y la exposición a altos niveles de radiación ultravioleta (UV). Esta cepa se constituyó en el primer caso de un hongo con un oscilador circadiano funcional a bajas temperaturas, lo cual planteó interesantes interrogantes sobre el rol de este mecanismo en la regulación de la producción de metabolitos de interés. En este trabajo se abordó la caracterización genómica de la cepa CRUB 1823, la caracterización molecular de su reloj circadiano, y su relación con la producción de compuestos fotoprotectores. Además, las interrogantes abiertas sobre la diversidad de los hongos y de sus relojes condujo a la exploración de la diversidad e historia evolutiva de sus osciladores circadianos. Se generaron datos genómicos y transcriptómicos de alta calidad que permitieron un análisis robusto del repertorio génico de la cepa y de su diversidad respecto de otros aislamientos alrededor del mundo. El análisis comparativo reveló que CRUB 1823 representa una variedad en una etapa temprana del proceso de especiación, con genes únicos asociados probablemente con la adaptación a su hábitat y a su huésped. Se identificaron y caracterizaron las proteínas putativas del oscilador circadiano central, las cuales presentaron una similitud significativa con aquellas del modelo fúngico en cronobiología, Neurospora crassa. La búsqueda de genes codificantes de proteínas del reloj circadiano en más de 2000 genomas de hongos reveló que la composición de los osciladores es diversa entre y dentro de las distintas divisiones de Fungi. Notablemente, un hito de este trabajo fue la detección por primera vez de posibles homólogos de los genes que codifican las proteínas FRQ y WC en grupos tan antiguos como Chytridiomycota. Este resultado siembra un antecedente para comenzar a reescribir una parte de la historia evolutiva del reloj circadiano de hongos. Finalmente, el borrador genómico y las anotaciones funcionales fueron utilizadas para estudiar la respuesta temprana de CRUB 1823 a una exposición continua de 5 minutos de luz UV, con especial énfasis en los genes circadianos y fotoprotectores. Los análisis de expresión diferencial y de sobrerrepresentación revelaron que la cepa reaccionó enriqueciendo varias vías relacionadas con el mantenimiento de la estabilidad genómica y la viabilidad celular, además de co-regular la expresión de varios genes promisorios para aplicaciones industriales. La respuesta temprana al estrés por UV también se caracterizó por la sobreexpresión del gen central del reloj circadiano, frq, sugiriendo un acoplamiento entre las respuestas transcripcionales asociadas al reloj y relacionadas con el estrés oxidativo.

In recent years, yeast and other wild fungi sequencing have shed light on various questions about their origin, adaptation, and evolution. Variants isolated from diverse environments have revealed a plethora of genes with the potential to encode compounds of applied interest, while the discovered genomic diversity has helped clarify the evolutionary history of various species. The natural history of the northwest Patagonia has shaped the evolution of genomes of diverse organisms in the region, including microorganisms. The changing and challenging environment has contributed to creating and maintaining a hotspot of diversity of different yeast species that has barely begun to be explored. Aureobasidium pullulans, a yeast-like fungus with remarkable phenotypic plasticity widely studied for its industrial importance, is the dominant species on the phylloplane of the Andean-Patagonian forest. A. pullulans CRUB 1823 is a strain isolated from this environment subjected to cold, wind desiccation, and exposure to high levels of ultraviolet (UV) radiation. This strain became the first case of a fungus with a functional circadian oscillator at low temperatures, raising interesting questions about the role of this mechanism in regulating the production of metabolites of interest. This work addressed the genomic characterization of the CRUB 1823 strain, the molecular characterization of its circadian clock, and its relationship with the production of photoprotective compounds. Additionally, open questions about fungal diversity and their clocks led to the exploration of the diversity and evolutionary history of their circadian oscillators. High-quality genomic and transcriptomic data were generated, allowing a robust analysis of the strain's gene repertoire and its diversity compared to other isolates worldwide. Comparative analysis revealed that CRUB 1823 represents a variety in an early stage of the speciation process, with unique genes likely associated with adaptation to its habitat and host. The putative proteins of the central circadian oscillator were identified and characterized, showing significant similarity to those of the fungal model in chronobiology, Neurospora crassa. The search for genes encoding circadian clock proteins in over 2000 fungal genomes revealed that the composition of the oscillators is diverse among and within different divisions of Fungi. Notably, a milestone of this work was the first detection of possible homologs of the genes encoding FRQ and WC proteins in ancient groups such as Chytridiomycota. This result sets a precedent for beginning to rewrite a part of the evolutionary history of fungal circadian clocks. Finally, the draft genome and functional annotations were used to study the early response of CRUB 1823 to a continuous 5-minutes exposure to UV light, with special emphasis on circadian and photoprotective genes. Differential expression and overrepresentation analyses revealed that the strain responded by enriching several pathways related to maintaining genomic stability and cellular viability, as well as co-regulating the expression of several promising genes for industrial applications. The early response to UV stress was also characterized by the overexpression of the central clock gene, frq, suggesting a coupling between transcriptional responses associated with the clock and those related to oxidative stress.